โดยทั่วไป การตรวจชิ้นเนื้อทางพยาธิวิทยา จะย้อมสี Hematoxylin & Eosin ในบางครั้งจำเป็นต้องย้อมสีพิเศษต่างๆ ช่วยในการวินิจฉัย เช่น ย้อม Iron เพื่อศึกษาเหล็กในเนื้อเยื่อ, ย้อม AFB เพื่อศึกษา acid fast mycobacteria, Gomori’s methenamine silver (GMS) เพื่อศึกษาfungi แต่จะมีเนื้อเยื่อที่ไม่สามารถวินิจฉัยได้แน่นอน เช่น ในโรคติดเชื้อ และมะเร็งหลายชนิดซึ่งแต่ละชนิดมีความแตกต่างกันทั้งตำแหน่งและโครงสร้างของเซลล์ ถ้ามีการแพร่กระจายหรือรูปร่างเปลี่ยนไปก็จะทำให้แปรผลได้ยาก จึงจำเป็นต้องอาศัยการตรวจด้วยวิธีอิมมูโนฮีสโตเคมีเพี่อตรวจหาแอนติเจนต่าง ทังที่อยู่บนผิวเซลล์, ภายในเซลล์ และภายในนิวเคลียส ซึ่งปัจจุบันได้มีการนำวิธีนี้มาใช้ในการวินิจฉัยโรคอย่างแพร่หลาย สามารถตรวจหา tumour markers, hormone, enzyme, protein, bacteria และ virus ช่วยพยาธิแพทย์ในการบ่งชี้และแบ่งแยกเซลล์เนื้องอกว่าเป็นเนื้องอกธรรมดา หรือ ชนิดร้ายแรง

ระยะแรก การศึกษาทางอิมมูโนสำหรับชิ้นเนื้อมีเฉพาะวิธี อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ ซึ่งเป็นการใช้สารเรืองแสง(Fluorescein) ติดกับแอนติบอดี วิธีนี้มีข้อจำกัดคือ ต้องใช้เนื้อสด, ต้องตัดด้วยเครื่อง cryostat และต้องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เท่านั้น นอกจากนี้ สารเรืองแสงจะเสื่อมสภาพเมื่อถูกแสงสว่าง ต้องเก็บสไลด์ในตู้เย็น และเก็บได้ไม่นาน จะเก็บได้เฉพาะรูปถ่ายเท่านั้น

ในระยะต่อมา ผู้ค้นคว้านำ enzyme มาเชื่อมติดกับแอนติบอดีเพื่อใช้แทนสารเรืองแสง ซึ่งเมื่อ enzymeทำปฏิกิริยากับ substrate (H2O2) เมื่อหยด Chromogen (DAB) จะปรากฏสีตรงตำแหน่งของเนื้อเยื่อที่มีแอนติบอดี้ไปจับอยู่กับแอนติเจน วิธีนี้สามารถดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ธรรมดา และศึกษาจาก paraffin section ได้ และสามารถเก็บสไลด์เป็นสไลด์ถาวรได้

วิธีนี้แบ่งเป็น 2 แบบ ใหญ่ๆ ได้แก่

1. Direct method ทำโดยการใช้ แอนติบอดีที่ conjugate กับ enzyme (horse radish peroxidase หรือ alkaline phosphatase) มาจับกับแอนติเจน แล้วทำให้เกิดสี วิธีการนี้จะมี sensitivity น้อย

2. Indirect method ใช้แอนติบอดี สองชนิด ชนิดแรก คือ Primary antibody ที่มีความจำเพาะต่อสิ่งที่ต้องการจะตรวจหานั้นๆ โดย secondary antibody จะ conjugate enzyme ไว้แล้ว วิธีการนี้ทำให้ sensitivity ดีขึ้น

    2.1 Unlabelled antibody method เป็นการใช้ secondary antibody เป็นสะพานเชื่อมระหว่าง primary antibody กับ teriary antibody ที่มี enzyme complex conjugate อยู่ วิธีการนี้ได้แก่ Peroxidase antiperoxidase complex (PAP), alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase complex (APAAP)

    2.2 (Strept)avidin-biotin technology เป็นวิธีการที่อาศัยคุณสมบัติในการจับตัวกันของ avidin และ biotin ที่จะยึดตัวกันอย่างแน่นหนาและจำเพาะเจาะจง avidin เป็นส่วนประกอบของไข่ขาว structure เป็นรูปสี่เหลี่ยมมี 4 submit ที่จะให้ biotin เกาะได้ ส่วน biotin เป็น low molecular weight vitamin ที่สามารถจะ conjugate กับ antibody และenzymeได้ง่าย จึงทำให้สามารถที่จะใช้ biotin conjugate กับ secondary antibody และสร้าง avidin biotin enzyme complex เพื่อใช้แทน PAP or APAAP complex ตัว avidin จะมี oligosaccharide residue ของไข่ขาวติดมาด้วย สารตัวนี้มักจะไปจับกับ lecitin บนเนื้อเยื่อได้ ทำให้เกิด nonspecific staining จึงมีการทดแทน avidin ด้วยสาร streptavidin ซึ่งได้จากการเพาะเลี้ยงเชื้อแบคทีเรีย Streptomyces avidinii สารตัวนี้ไม่มี oligosaccharide residue และมีคุณสมบัติในการจับกับ biotin เช่นเดียวกับ avidin

วิธีการนี้ ได้แก่

- avidin-biotin complex(ABC) method

- labeled avidin-biotin(LAB) method

- labeled streptavidin-biotin(LSAB) method

    2.3 Chain polymer-conjugate Technology เป็นเทคนิคที่ใช้ enzyme (HRP,AP) และ antibody ( primary, secondary ) มาติดบน spine molecule ของdextran และใน 1 spine molecule ของ dextran สามารถติดenzymeได้ 70 molecules พร้อมกับantibody อีก 10 molecules ด้วยเหตุนี้ เทคนิคนี้จึงช่วยเพิ่ม sensitvity ลดเวลาและขั้นตอนในการทำ IHCได้ ตัวอย่างเช่น DAKO EPOS, DAKO EnVision เป็นต้น

เนื่องจากเทคนิคนี้ไม่มีการใช้avidin, biotin จึงไม่ทำให้เกิด nonspecific staining จาก endogenous biotin

สิ่งส่งตรวจ

สิ่งส่งตรวจที่สามารถนำมาตรวจด้วยเทคนิค IHC มีหลายชนิด ดังนี้

• Fresh frozen sections
• Cytological preparations
• Formalin-fixed, paraffin-embedding specimens
• Fine-needle aspiration(FNA) specimens

Slide Preparation

เป็นการเตรียมสไลด์โดยนิยมเคลือบด้วย 3-aminopropyltriethoxysilane (Sigma A3648) เพื่อป้องกันการหลุดหายของเซลล์ หรือชิ้นเนื้อในระหว่างการทำ