วิธีการเตรียมและการย้อม

ขั้นตอนการเตรียม slides ชิ้นเนื้อ ก่อนย้อม

1. ตัด tissue section จาก paraffin block ด้วย เครื่อง Microtome ให้มีความหนา 3-4 microns ลอยในอ่างน้ำอุณหภูมิ ประมาณ 43 องศาเซลเซียส (ห้ามโรยเจลาติน)

2. อบSlide (เลือกวิธีการใดวิธีการหนึ่ง แล้วแต่สะดวก)

3. Deparaffinization ด้วย Xylene 3 นาที 3 ครั้ง

4. Rehydration ด้วย

• Abs. Ethanol
• 95% ethanol
• น้ำกลั่น

5. Retrieve Antigen

     5.1. ใช้ Hi-power ตั้งเวลาให้น้ำยาเดือด 5 นาที (เฉพาะเครื่องMicrowave LG 800 watt) 

     5.2. เมื่อน้ำยาเดือดแล้วให้ลด Power ลงเหลือประมาณ Low Power แล้วตั้งเวลาอีก 10 นาที 

     5.3. เอาออกมาตั้งทิ้งไว้ให้เย็นที่อุณหภูมิห้องอีก 20 นาที หรือ เป่าด้วยพัดลมช่วยให้เย็นเร็วขึ้น

     5.4. ล้างด้วยน้ำประปาไหลผ่าน 5 นาที แล้วลงน้ำกลั่น

6. เช็ดรอบๆ section ด้วยผ้าก็อสหรือกระดาษชำระ แล้ววงด้วย Pen for IHC แล้วจุ่ม slide ในน้ำกลั่น

7. Peroxidase – Blocking Reaqent

• หยด Peroxidase – Blocking Reagent (3% H2O2 ในน้ำกลั่น : 30%ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ที่เก็บในช่อง Freeze ในตู้เย็น+น้ำกลั่น 9 ml ) Incubateใน Chamber ทิ้งไว้ที่ อุณหภูมิห้อง 10 นาที (กรณี marker ที่เป็นCD ต่างๆ สามารถ Incubate ได้นานถึง20 นาที)
  (นำ Protein block serum – free (X0909) ออกจากตู้เย็น มาตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง)
• Running น้ำประปา 5 นาที
• ล้างด้วย Wash Buffer 5 นาที 2 ครั้ง(นำ Primary Antibody แบบ Ready-to-Use ออกจากตู้เย็น มาตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง)

8. Nonspecific Protien – Blocking

• หยด proteins block serum- free (X0909) Incubateใน Chamber ทิ้งไว้ที่ อุณหภูมิห้อง 10 นาที
• เคาะออก

ขั้นตอนการย้อม

1. Primary Antibody แบบ Ready-to-Use หรือ Negative Control Reagent

• หยด Primary Antibody หรือ Negative Control Reagent Incubateใน Humidity Chamberที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 30 นาที(นำ Label Polymer ใน EnVision Kit ออกจากตู้เย็น มาตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง)
• Rinse ด้วย Wash Buffer
• ล้างด้วย Wash Buffer 5 นาที 2 ครั้ง

2. EnVision Detection System (Peroxidase labeled polymer)

• หยด Label Polymer ใน EnVision Kit 100-200 µL incubateใน Humidity Chamberที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที
  (กรณี CD3 และ marker ที่ติด nucleus เช่น ER, PR, P53, Ki-67 ควร Incubate 30 นาที)
• ล้างด้วย Wash Buffer 5 นาที 2 ครั้ง
• เตรียม Substrate – Chromogen Detection (DAB)
  โดยใช้ DAB substrate buffer 1 ml. ต่อ DAB liquid 1 หยด

3. Substrate – Chromogen Detection (DAB)

• หยด DAB Incubate 5 นาที (100-200 µL)
• Running น้ำประปา 10 นาที (เพื่อหยุดปฏิกิริยา DAB)
• ลงน้ำกลั่น

4. Counterstain

• จุ่มใน Hematoxylin 2 นาที (หรือขึ้นกับความเข้มข้นของ Hematoxylin ที่ใช้)
• Running น้ำประปา 5 นาที

5. Dehydration and Clearing (ตามขั้นตอนของแต่ละห้องปฏิบัติการ)

6. Mounting

•  ใช้ Permount สำหรับ Permanent Mounting Medium