dot dot
dot
วิธีการ COAT SLIDES เพื่อใช้ในงาน IMMUNOHISTOCHEMISTRY
dot
bulletวิธีการ COAT SLIDES
bulletอุปกรณ์และน้ำยาที่ต้องเตรียม
dot
ความรู้เบื่องต้นทางด้านอิมมูโนพยาธิวิทยา
dot
bulletอิมมูโนพยาธิวิทยา (Immunohistochemistry)
bulletการเตรียมตัวอย่างเพื่อศึกษาทางอิมมูโนพยาธิวิทยา
bulletProtocol การย้อม Immunohistochemistry
bulletสรุปขั้นตอนการย้อม IHC โดยใช้ EnVision kit เป็น detection System
dot
Flow Cytometry Research Reagents
dot
bulletFlow Cytometry Research Reagents
dot
Apoptosis Kits
dot
bulletApoptosis Kits
dot
คำถาม

dot




Protocol การย้อม Immunohistochemistry

 

วิธีการเตรียมและการย้อม

 

ขั้นตอนการเตรียม slides ชิ้นเนื้อ ก่อนย้อม

1.ตัด  tissue section จาก paraffin block ด้วย เครื่อง Microtome ให้มีความหนา 3-4 microns ลอยในอ่างน้ำอุณหภูมิ ประมาณ 43 องศาเซลเซียส (ห้ามโรยเจลาติน)

             

2.อบSlide (เลือกวิธีการใดวิธีการหนึ่ง แล้วแต่สะดวก)

 

3. Deparaffinization ด้วย Xylene 3 นาที 3 ครั้ง

 

4. Rehydration ด้วย

-         Abs. Ethanol

-         95% ethanol

-         น้ำกลั่น   

5. Retrieve Antigen  

           5.1. ใช้ Hi-power ตั้งเวลาให้น้ำยาเดือด 5 นาที  (เฉพาะเครื่องMicrowave LG 800 watt)

 

           5.2.  เมื่อน้ำยาเดือดแล้วให้ลด Power ลงเหลือประมาณ Low Power แล้วตั้งเวลาอีก 10 นาที

 

           5.3. เอาออกมาตั้งทิ้งไว้ให้เย็นที่อุณหภูมิห้องอีก 20 นาที หรือ เป่าด้วยพัดลมช่วยให้เย็นเร็วขึ้น

 

           5.4. ล้างด้วยน้ำประปาไหลผ่าน 5 นาที แล้วลงน้ำกลั่น

 

6.เช็ดรอบๆ section ด้วยผ้าก็อสหรือกระดาษชำระ แล้ววงด้วย  Pen for IHC แล้วจุ่ม slide ในน้ำกลั่น

 

7 Peroxidase – Blocking  Reaqent

-  หยด Peroxidase – Blocking Reagent (3% H2O2 ในน้ำกลั่น : 30%ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ที่เก็บในช่อง Freeze ในตู้เย็น+น้ำกลั่น 9 ml ) Incubateใน Chamber ทิ้งไว้ที่ อุณหภูมิห้อง 10 นาที (กรณี marker ที่เป็นCD ต่างๆ สามารถ Incubate ได้นานถึง20 นาที)

(นำ Protein block serum – free (X0909) ออกจากตู้เย็น มาตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง)

 

-  Running น้ำประปา 5 นาที

-   ล้างด้วย Wash Buffer 5 นาที  2 ครั้ง(นำ Primary Antibody แบบ Ready-to-Use ออกจากตู้เย็น มาตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง)

 

8.Nonspecific Protien – Blocking  

-   หยด proteins block serum- free (X0909)   Incubateใน Chamber ทิ้งไว้ที่ อุณหภูมิห้อง 10 นาที

-   เคาะออก

 

ขั้นตอนการย้อม

1. Primary Antibody แบบ Ready-to-Use หรือ Negative Control Reagent  

-     หยด Primary Antibody  หรือ  Negative Control Reagent  Incubateใน Humidity Chamberที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 30 นาที(นำ Label Polymer ใน EnVision Kit ออกจากตู้เย็น มาตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง)

-     Rinse ด้วย Wash Buffer

-     ล้างด้วย Wash Buffer 5 นาที 2 ครั้ง

 

2. EnVision Detection System (Peroxidase labeled polymer)

-        หยด Label Polymer ใน EnVision Kit  100-200 µL incubateใน Humidity Chamberที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที

      (กรณี CD3 และ marker ที่ติด nucleus เช่น ER, PR, P53, Ki-67 ควร Incubate 30 นาที)

-         ล้างด้วย Wash Buffer 5 นาที 2 ครั้ง

เตรียม Substrate – Chromogen Detection (DAB)

     โดยใช้ DAB substrate buffer 1 ml. ต่อ  DAB liquid 1 หยด

 

3. Substrate – Chromogen Detection (DAB)  

-         หยด DAB Incubate 5 นาที (100-200 µL)  

-         Running น้ำประปา 10 นาที (เพื่อหยุดปฏิกิริยา DAB)

-         ลงน้ำกลั่น

 

4. Counterstain

-         จุ่มใน Hematoxylin 2 นาที (หรือขึ้นกับความเข้มข้นของ Hematoxylin ที่ใช้)

-         Running น้ำประปา 5 นาที

 

5. Dehydration and Clearing (ตามขั้นตอนของแต่ละห้องปฏิบัติการ)

 

6. Mounting

 - ใช้ Permount สำหรับ Permanent Mounting Medium








Copyright © 2010 All Rights Reserved.