ขั้นตอนการเตรียม slides ชิ้นเนื้อ ก่อนย้อม

1.ตัด  tissue section จาก paraffin block ด้วย เครื่อง Microtome ให้มีความหนา 3-4 microns ลอยในอ่างน้ำอุณหภูมิ ประมาณ 43 องศาเซลเซียส (ห้ามโรยเจลาติน)

             

2.อบSlide (เลือกวิธีการใดวิธีการหนึ่ง แล้วแต่สะดวก)

 

3. Deparaffinization ด้วย Xylene 3 นาที 3 ครั้ง

 

4. Rehydration ด้วย

-         Abs. Ethanol

-         95% ethanol

-         น้ำกลั่น   

5. Retrieve Antigen  

           5.1. ใช้ Hi-power ตั้งเวลาให้น้ำยาเดือด 5 นาที  (เฉพาะเครื่องMicrowave LG 800 watt)

 

           5.2.  เมื่อน้ำยาเดือดแล้วให้ลด Power ลงเหลือประมาณ Low Power แล้วตั้งเวลาอีก 10 นาที

 

           5.3. เอาออกมาตั้งทิ้งไว้ให้เย็นที่อุณหภูมิห้องอีก 20 นาที หรือ เป่าด้วยพัดลมช่วยให้เย็นเร็วขึ้น

 

           5.4. ล้างด้วยน้ำประปาไหลผ่าน 5 นาที แล้วลงน้ำกลั่น

 

6.เช็ดรอบๆ section ด้วยผ้าก็อสหรือกระดาษชำระ แล้ววงด้วย  Pen for IHC แล้วจุ่ม slide ในน้ำกลั่น

 

7 Peroxidase – Blocking  Reaqent

-  หยด Peroxidase – Blocking Reagent (3% H₂O₂ ในน้ำกลั่น : 30%ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ที่เก็บในช่อง Freeze ในตู้เย็น+น้ำกลั่น 9 ml ) Incubateใน Chamber ทิ้งไว้ที่ อุณหภูมิห้อง 10 นาที (กรณี marker ที่เป็นCD ต่างๆ สามารถ Incubate ได้นานถึง20 นาที)

(นำ Protein block serum – free (X0909) ออกจากตู้เย็น มาตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง)

 

-  Running น้ำประปา 5 นาที

-   ล้างด้วย Wash Buffer 5 นาที  2 ครั้ง(นำ Primary Antibody แบบ Ready-to-Use ออกจากตู้เย็น มาตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง)

 

8.Nonspecific Protien – Blocking  

-   หยด proteins block serum- free (X0909)   Incubateใน Chamber ทิ้งไว้ที่ อุณหภูมิห้อง 10 นาที

-   เคาะออก

 

ขั้นตอนการย้อม

1. Primary Antibody แบบ Ready-to-Use หรือ Negative Control Reagent  

-     หยด Primary Antibody  หรือ  Negative Control Reagent  Incubateใน Humidity Chamberที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 30 นาที(นำ Label Polymer ใน EnVision Kit ออกจากตู้เย็น มาตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง)

-     Rinse ด้วย Wash Buffer

-     ล้างด้วย Wash Buffer 5 นาที 2 ครั้ง

2. EnVision Detection System (Peroxidase labeled polymer)

-        หยด Label Polymer ใน EnVision Kit  100-200 µL incubateใน Humidity Chamberที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที

      (กรณี CD3 และ marker ที่ติด nucleus เช่น ER, PR, P⁵³, Ki-67 ควร Incubate 30 นาที)

-         ล้างด้วย Wash Buffer 5 นาที 2 ครั้ง

เตรียม Substrate – Chromogen Detection (DAB)

     โดยใช้ DAB substrate buffer 1 ml. ต่อ  DAB liquid 1 หยด

3. Substrate – Chromogen Detection (DAB)  

-         หยด DAB Incubate 5 นาที (100-200 µL)  

-         Running น้ำประปา 10 นาที (เพื่อหยุดปฏิกิริยา DAB)

-         ลงน้ำกลั่น

4. Counterstain

-         จุ่มใน Hematoxylin 2 นาที (หรือขึ้นกับความเข้มข้นของ Hematoxylin ที่ใช้)

-         Running น้ำประปา 5 นาที

5. Dehydration and Clearing (ตามขั้นตอนของแต่ละห้องปฏิบัติการ)

6. Mounting

 - ใช้ Permount สำหรับ Permanent Mounting Medium