dot dot
dot
วิธีการ COAT SLIDES เพื่อใช้ในงาน IMMUNOHISTOCHEMISTRY
dot
bulletวิธีการ COAT SLIDES
bulletอุปกรณ์และน้ำยาที่ต้องเตรียม
dot
ความรู้เบื่องต้นทางด้านอิมมูโนพยาธิวิทยา
dot
bulletอิมมูโนพยาธิวิทยา (Immunohistochemistry)
bulletการเตรียมตัวอย่างเพื่อศึกษาทางอิมมูโนพยาธิวิทยา
bulletProtocol การย้อม Immunohistochemistry
bulletสรุปขั้นตอนการย้อม IHC โดยใช้ EnVision kit เป็น detection System
dot
Flow Cytometry Research Reagents
dot
bulletFlow Cytometry Research Reagents
dot
Apoptosis Kits
dot
bulletApoptosis Kits
dot
คำถาม

dot




การเตรียมตัวอย่างเพื่อศึกษาทางอิมมูโนพยาธิวิทยา

การเตรียมตัวอย่างเพื่อศึกษาทางอิมมูโนพยาธิวิทยา( การเตรียมชิ้นเนื้อจากParaffin Sections)

 

1. Fixation and  Embedding

ตัวอย่างที่จะนำมาศึกษาจำเป็นอย่างยิ่งที่ต้องผ่านการเตรียมชิ้นเนื้อที่ดี จะต้องรักษาคุณสมบัติของแอนติเจนในตัวอย่างนั้นไว้

Fixation  เป็นการรักษาสภาพของเซลล์และเนื้อเยื่อต่างๆ รวมทังรักษาสภาพของแอนติเจนที่ต้องการตรวจหาให้อยู่ในสภาพเดิม หรือหลีกเลี่ยงการทำลายต่อ antigen determinant หรือ epitope  (ตำแหน่งย่อยๆ บนแอนติเจนที่สามารถทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีที่จำเพาะ) ทั้งนี้ขึ้นกับคุณสมบัติของแอนติเจนนั้นๆ บางชนิดอาจทนกับ fixative ชนิดหนึ่ง แต่อาจจะไม่ทนต่อชนิดอื่นๆ หรือแอนติเจนหลายๆ ตัวอาจถูกทำลายโดย fixative ทุกชนิด เมื่อต้องการศึกษาทางอิมมูโนฮีสโตเคมีจะต้องย้อมจาก cryosections อีกทั้งเนื้อเยื่อที่ไม่ได้ fix แอนติเจนอาจจะหายไป หรือแพร่กระจายไปยังเนื้อเยื่อข้างเคียง หรือเนื้อเยื่อที่fixนานเกินไปอาจจะเกิดcross-linking ทำให้แอนติเจนถูกปิดบัง (masking) หรืออาจถูกทำลาย เป็นบางส่วน ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับชนิดของ fixative และระยะเวลาการfix สภาวะที่เหมาะสมก็คือชิ้นเนื้อที่บางและเวลา fix ที่สั้น  ดังนั้น การ fix นานเกินไปทำให้แอนติเจนถูกปิดบัง และรบกวนผลการย้อมได้ ปัจจุบันยังไม่มี fixative ชนิดใดที่เหมาะสำหรับแอนติเจนทุกชนิด

10% Formalin หรือ 10% neutral buffer formalin เป็น  fixative ซึ่งใช้กันแพร่หลาย ระยะเวลาในการ fix เนื้อเยื่อโดยสมบูรณ์จะประมาณ 18-24 ชั่วโมง Fixative ขนาดของชิ้นเนื้อที่เหมาะสมคือ 10x10x3 มม. ใช้เวลาfix 6-8 ชม.  ผ่านขบวนการเตรียมชิ้นเนื้อด้วยเครื่องอัตโนมัติโดยผ่านน้ำยาเคมีต่างๆ เช่น  alcohol, acetone,  xylene , paraffin และนำชิ้นเนื้อนั้นมา embed ใน paraffin ซึ่งอุณหภูมิไม่ควรเกิน 56 องศาเซลเซียส

 

2. Sectioning of tissue

ตัด paraffin section ด้วยเครื่อง Microtome หนา 3 micron ลอยในอ่างน้ำอุณหภูมิประมาณ 43องศาเซลเซียส ใช้สไลด์เคลือบด้วย 3-aminopropyltriethoxysilane เพื่อป้องกันชิ้นเนื้อหลุด รอให้ section แห้งสนิท นำเข้าตู้อบ อุณหภูมิ 56 องศาเซลเซียส ทิ้งไว้ข้ามคืน

 

3. Deparaffinization and Rehydration

คือการล้าง paraffin ที่เคลือบ section ด้วย xylene ผ่านไปยัง alcohol จากเปอร์เซ็นต์สูงไปต่ำแล้วแช่ในน้ำกลั่น ไม่ควรปล่อยให้สไลด์แห้ง

หากมีความจำเป็น สามารถเก็บ tissue slides ที่ rehydrated แล้ว ที่ 2-8 องศาเซลเซียส ใน Buffer ได้นานถึง18 ชั่วโมง โดยก่อนใช้ให้นำมาวางที่อุณหภูมิห้อง 20-25 องศาเซลเซียส ก่อนการย้อมต่อไป โดยไม่รบกวนผลการย้อม

 

4. Blocking Endogenous Enzyme

เอ็นไซม์ที่มีอยู่ใน  section   จะทำให้เกิดการติดสีที่ไม่จำเพาะ คือไม่ได้เกิดจากการจับกันระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดี  ต้องยับยั้งก่อนทุกครั้ง มิฉะนั้น จะทำให้เกิดผลบวกผิดพลาด หรือ background staining เอ็นไซม์ส่วนใหญ่พบในเม็ดเลือดขาว, เม็ดเลือดแดง และเซลล์ตับ ซึ่งสามารถยับยั้งได้โดยใช้ substrate ของมันคือ 3%Hydrogen peroxide ในน้ำ หรือ   0.5%Hydrogen peroxide ใน methanol  incubate 10-30 นาที แล้วแต่ชนิดของชิ้นเนื้อ

 

 5. Antigen Retrieval Technique    การคืนสภาพแอนติเจน  (Antigen unmasking or Antigen retrieval technique)

เป็นการคืนสภาพแอนติเจนหรือเพิ่มความเป็นแอนติเจนของเนื้อเยื่อต่างๆ เนื้อเยื่อซึ่ง fix ด้วย formalin ซึ่งเป็นcross-linking fixative จะทำให้เกิดการจับตัวกัน (bridging) ระหว่างamino acid ภายในโมเลกุลเดียวกันและจับตัวกับโมเลกุลที่อยู่ข้างเคียง ขบวนการนี้เป็นสาเหตุที่สำคัญที่เชื่อว่าเป็นตัวการในการ block ไม่ให้ antibody  เข้าไปจับตัวกับ antigen determinant(epitope) ได้ ขบวนการนี้เรียกว่า masking of antigen ในการทำ IHC จึงจำเป็นที่จะต้องแก้ปัญหาที่เกิดขึ้นนี้ การทำ epitope retrieval จึงเป็นวิธีการหนึ่งที่ใช้ในการ de-masking protein ที่ antigenic determinant ก่อนที่จะนำเนื้อเยื่อนั้นๆ มาย้อมโดยวิธีอิมมูโนฮีสโตเคมีทำให้การย้อมติดสีดีขึ้น   

 

      วิธีการคืนสภาพแอนติเจน สามารถทำได้ หลายวิธี ได้แก่

 

5.1 โดยใช้เอนไซม์(Enzymatic unmasking technique) โดยทั่วไปเอนไซม์ที่ใช้ได้แก่ protease,

trypsin, pepsin, proteinase K, ficin, pronase ในปี 1976  Huang และคณะได้นำenzyme มาย่อยชิ้นเนื้อก่อนที่จะนำมาย้อมด้วยวิธีอิมมูโนฮีสโตเคมี เนื่องจากการ fix  ชิ้นเนื้อด้วยฟอร์มาลินจะทำให้เกิดพันธะระหว่างโปรตีน(Aldehyde linkage หรือ methylene bridge) เกิดการเชื่อมกันของโปรตีน ทำให้มีการเปลี่ยนแปลงหรือปิดบังตำแหน่งที่ทำหน้าที่เป็นแอนติเจนของโปรตีนบางชนิด การใช้เอ็นไซม์ย่อยพันธะดังกล่าวจะช่วยคืนสภาพของแอนติเจนหลายชนิด ทำให้การย้อมอิมมูโนฮีสโตเคมีติดสีดีขึ้น แต่ก็ไม่สามารถใช้ได้ดีกับแอนติเจนทุกชนิดได้ เพราะแอนติเจนบางชนิดไม่สามารถคืนสภาพได้ด้วยการใช้เอ็นไซม์ย่อย โดยเฉพาะชิ้นเนื้อที่ fix ฟอร์มาลินเป็นเวลานาน    โดยใช้เอ็นไซม์ที่นิยมใช้คือ

0.1% Trypsin ใน 0.1% CaCl2, pH 7.8

0.4% Pepsin ใน 0.01 N Hydrochloric acid

0.1% Pronase ใน 0.5 M HCl, pH 7.5

5.2 โดยวิธีการทางฟิสิกส์  (Physical methods)โดยทั่วไปใช้ความร้อน  (Heat induced antigen retrieval -

 technique) โดยการทำให้เดือดในสารละลายโลหะหนัก ซึ่งมีผลทำให้แอนติเจนหลายชนิดซึ่งย้อมได้ยาก หรือย้อมไม่ได้เลยในชื้นเนื้อที่ fix ด้วย formalin สามารถย้อมติดสีได้ ต่อมามีการนำความร้อนจากแหล่งต่างๆ เช่นไมโครเวฟ, หม้ออัดแรงดัน, เครื่องนึ่งฆ่าเชื้อโรค, ตู้อบ,

เตาไฟฟ้า ปรับเวลาและอุณหภูมิที่ใช้ เปลี่ยนแปลงสารละลายที่ใช้คืนสภาพ (antigen retrieval solution)เพื่อให้สามารถคืนสภาพแอนติเจนได้ผลดีที่สุด   ตัวอย่างของการใช้ความร้อน เช่น ไมโครเวฟ หม้ออัดความดัน solutionที่นิยมใช้คือ

                                10 mM Citrate Buffer, pH 6.0

                                 6 M Urea

                                10 mM EDTA, pH 8.0,9.0

      5.3 ใช้ทั้งเอ็นไซม์และความร้อนร่วมกัน สำหรับแอนติบอดีบางชนิด

                                นอกจากนี้  แอนติบอดีหลายชนิดซึ่งเดิมจำเป็นต้องใช้กับชิ้นเนื้อสดเท่านั้น เมื่อนำมาใช้ร่วมกับเทคนิดนี้ สามารถนำแอนติบอดีนั้นมาใช้กับพาราฟินบล็อกได้ด้วย

                การเลือกใช้วิธีคืนสภาพแอนติเจน ขึ้นอยู่กับชนิดของแอนติเจนและแอนติบอดีที่ต้องการศึกษา และ ขึ้นกับเครื่องมือที่มีใช้ในแต่ละห้องปฏิบัติการ ไม่ว่าจะเลือกใช้วิธีใด สิ่งที่สำคัญคือจะต้องปรับเวลาที่ใช้ในการคืนสภาพ, ชนิด และ dilution ของแอนติบอดีที่ใช้ให้เหมาะสม 

 

6. Blocking of nonspecific reaction

การจับการอย่างไม่จำเพาะเกิดขึ้นได้จากปฏิกิริยา hydrophobic bonding ระหว่างImmunoglobulin กับ

 tissue proteins  ทำให้ primary abs และบางส่วนของ secondary abs จับกับเนื้อเยื่อโดยตรง ได้ดีพอๆ กับแอนคิเจนเป้าหมาย  แก้ไขโดย ใช้ blocking protein ซึ่งอาจทำโดยเติมลงใน ab diluent หรือ แยกขั้นตอนออกไป โดยใช้ซีรั่มของสัตว์ชนิดเดียวกับที่ใช้เตรียมsecondary antibody หรือ 2-5%bovine serum albumin(BSA) ปัจจุบัน นิยมใช้serum free protein block มากกว่าการเติม Immunoglobulins เข้าไป

 

7. Primary Antibody

มีทั้ง polyclonal และ monoclonal antibodies ความเข้มข้นของ primary antibody ที่ใช้ในงานขึ้นอยู่กับปริมาณแอนติเจนและความไวของเทคนิดการย้อมที่ใช้ ไม่สามารถกำหนดให้เป็นมาตรฐานตายตัวไปได้ว่าจะใช้ dilution เท่าใด ต้องทดสอบกับ positive control ซึ่งควรเป็น dilution สูงสุดที่ให้ผลการย้อมติดสีชัดเจน และbackgroundน้อยที่สุด หรือไม่มีเลย

 

8. Secondary Antibody(Linking Antibody)

Linking antibody ต้องมีคุณสมบัติที่จะจับกับ primary antibody และEnzyme Immuno Complexเป็นperoxidase-conjugated antibody โดยเตรียมจากสัตว์ชนิดเดียวกับที่ใช้เตรียม primary antibody

 

9. Detection System

คือการตรวจหา antigen-antibody complexes ที่เกิดขึ้น วิธีที่ใช้ได้แก่

Soluble Enzyme Immune Complex Method :

        Peroxidase-antiperoxidase Complex (PAP) วิธีนี้อาจเรียกว่า unlabelled antibody method โดยใช้ Enzyme-antienzyme immune complex ที่ละลายน้ำได้  ประกอบไปด้วย  Enzyme Peroxidase 3 molecules และ Antibodies ที่จำเพาะต่อ Peroxidase Enzyme  2 molecules ลำดับขั้นตอนการย้อมได้แก่ unconjugated primary antibody, secondary antibody, soluble enzyme-antienzyme complex และ substrate solution  ทั้งนี้ primary antibody และ antibody ใน enzyme immune complex จะต้องเตรียมมาจากสัตว์ชนิดเดียวกัน ทำให้secondary antibody สามารถเชื่อมติดกับทั้งสองส่วน จึงมักเรียกSecondary Antibody ว่าเป็น link antibody ซึ่งจะต้องจำเพาะกับ immunoglobulins ของสัตว์ชนิดเดียวกันกับที่ใช้เตรียม primary antibody และ enzyme immune complex อีกทั้งSecondary antibodyจะต้องใส่ลงไปในปริมาณที่เกินไว้เพื่อให้ Fab sites จับกับ primary antibody และ Fab site อิสระ ก็จะจับกับ antibody จากenzyme immune complex

 

10. Substrate and Chromogen

Substrate ที่ใช้ทำปฏิกิริยากับเอนไซม์เพื่อให้ได้สีต่างๆ Substrate สำหรับ peroxidase คือ hydrogen peroxide (H2O2) 

Chromogen ที่นิยมใช้มีหลายชนิด เช่น

10.1 3, 3 Diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB) ให้ end product สีน้ำตาล ไม่ละลายน้ำ, alcohol และxylene การติดสีคงทนถาวร

10.2 3 Amino-9-ethyl carbazole(AEC) ให้ end product สีแดง ละลายใน alcohol และ xylene สีแดงของ AEC จะจางลงเมื่อโดนแสงสว่างหรือไว้นาน ฉะนั้นจึงต้องเก็บเป็นรูปถ่ายไว้

10.3 p Phenylene diamine dihydrochloride/pyrocathechol(Hanker Yates reagent) ให้ end product สีน้ำเงินดำ ไม่ละลายในน้ำ, alcohol หรือ xylene

10.4 4-Chloro-1-naphthol(CN) ให้ end product สีน้ำเงินดำ ไม่ละลายในน้ำ แต่ละลายใน alcohol

11. Counterstain

เป็นการย้อมเนื้อเยื่อที่ไม่ติดสีจากปฏิกิริยา IHC เพื่อให้เนื้อเยื่อติดสี counterstain ทำให้เห็นโครงสร้างเนื้อเยื่อชัดเจนและเปรียบเทียบกับส่วนที่ติดสีจากปฏิกิริยา IHC เพื่อให้เกิดความสะดวกในการตรวจวิเคราะห์  สีCounterstain ที่นิยมใช้ เช่น hematoxylin, methyl green, nuclear fast red เป็นต้น

 

12. Mounting Media

การเลือกใช้ขึ้นอยู่กับชนิดของ Chromogen

                12.1 Chromogen ที่ละลายใน alcohol ใช้ aqueous base medium เช่น glycerol, gelatin

                12.2 Chromogen ที่ไม่ละลายใน alcohol ใช้ solvent base medium เช่น permount








Copyright © 2010 All Rights Reserved.